Οι πρώτες σκέψεις για την ίδρυση της Σχολής του Σταυρού έγιναν το 1843 επί πατριάρχου Αθανασίου, δεν καρποφόρησαν όμως, λόγω των δύσκολων περιστάσεων και της ελλείψεως καταλλήλου προσώπου για τη διοργάνωση και τη διεύθυνσή της. Επί πατριάρχου Κυρίλλου υπήρχε ο κατάλληλος άνδρας, ο Διονύσιος Κλεόπας, αλλά και η ανάγκη για ίδρυση της Σχολής ήταν μεγαλύτερη, λόγω των ετεροδόξων, πού ίδρυσαν ναούς και Σχολές για την παραπλάνηση του ορθοδόξου λαού. Οι απαραίτητες προετοιμασίες έγιναν από το Διονύσιο Κλεόπα με την πλήρη υποστήριξη του πατριάρχου Κυρίλλου. Τα εγκαίνια έγιναν το 1855, μια δεκαετία περίπου μετά την Ίδρυση της Σχολής της Χάλκης. (1844).
Η ίδρυση της Σχολής μαρτυρεί την ύπαρξη νέων πνευματικών τάσεων στην αδελφότητα. Ήταν ευτύχημα το ότι τη διεύθυνσή της ανέλαβε ο Διονύσιος Κλεόπας, βαθύς θεολόγος επιστήμονας. Εργάστηκε με ζήλο για ένα μόνο χρόνο. Έπειτα διέκοψε, επειδή ορισμένοι αγιοταφίτες τον υποπτεύονταν, λόγω της εξαιρετικής του προπαίδειας, ως επικίνδυνο νεωτεριστή και διαστροφέα της ορθοδοξίας, και συνεχώς τον διέβαλλαν. Παρά τις παρακλήσεις του πατριάρχου Κυρίλλου να παραμείνει τουλάχιστον στην αδελφότητα και να εργάζεται επιστημονικά, αποδέχτηκε το διορισμό του ως καθηγητού της Θεολογικής Σχολής Αθηνών το 1856. Εκεί δημιούργησε νέα πνευματική κίνηση, αποτέλεσμα της Οποίας υπήρξε ο «Ευαγγελικός Κήρυξ», επιστημονικό θεολογικό σύγγραμμα, στο οποίο αποσύρθηκε από τη θέση αυτή λόγω ασθένειας, και υπηρέτησε ως έξαρχος του Παναγίου Τάφου στην Κύπρο. Πρόωρα τον βρήκε ο θάνατος το 1861 στην Κωνσταντινούπολη. Δεν πρόλαβε να ολοκληρώσει το έργο του, έθεσε τα θεμέλια πνευματικής κίνησης, πού συνεχίστηκε από άλλους.
Συνεχιστές του στη Διεύθυνση της Σχολής χρημάτισαν ο Νικόδημος Μητροπολίτης Κυζίκου και ο Γερμανός Γρηγοράς, μετέπειτα διευθυντής της Σχολής της Χάλκης. Επ’ αυτού (1859) επισκέφτηκε τη Σχολή ο πατριάρχης Κύριλλος και εξέδωσε σιγίλλιο γράμμα, στο οποίο διατυπώθηκε άριστα η σημασία και ο σκοπός της λειτουργίας της Σχολής.
Το 1859 απολύθηκαν οι πρώτοι απόφοιτοι, και η Σχολή απόκτησε πλήρες φιλολογικό και θεολογικό πρόγραμμα και εξισώθηκε προς τη Σχολή της Χάλκης. Λειτούργησε κανονικά μέχρι το 1876 με διευθυντές, ύστερα από τους δύο προαναφερθέντες, τον Κύριλλο Αθανασιάδη, τον Αρχιδιάκονο Φώτιο, τον Ιερώνυμο Μυριανθέα και τον Επιφάνιο Ματτέο.
Επί Φωτίου η Σχολή απόκτησε τέλειο θεολογικό χαρακτήρα. Ονομαστοί καθηγητές της στο Διάστημα αυτό υπήρξαν ο Λέανδρος Αρβανιτάκης, σπουδαίος φιλόλογος, ο Γρηγόριος Παλαμάς, ο Βενιαμίν Ιωαννίδης, συγγραφέας του προσκυνηταρίου της Αγίας Γής, και άλλοι αγιοταφίτες, πού συνέχιζαν τις σπουδές τους στην Ευρώπη, μετά τη αποφοίτησή τους και επιδίδονταν εν συνεχεία στη μελέτη και έκδοση των αρχαίων συγγραμμάτων και στη συγγραφή παλαιστινολογικών και θεολογικών μελετών. Παράδειγμα η βιογραφία του πατριάρχη Ανθίμου από το Διονύσιο Κλεόπα ως εισαγωγή στο σύγγραμμα «Ερμηνεία των Ψαλμών» του ως άνω πατριάρχη. Παράδειγμα επίσης οι Κατηχήσεις του Αγίου Κυρίλλου Ιεροσολύμων, πού επεξεργάστηκαν κριτικά και σχολιάστηκαν από το Διονύσιο Κλεόπα και εκδόθηκαν από τον Αρχιδιάκονο Φώτιο το 1867.
Η Σχολή διέκοψε τη λειτουργία της το 1876, ύστερα από τα λυπηρά γεγονότα της πατριαρχείας του Κυρίλλου και την κατάσχεση των αγιοταφιτικών Μοναστηριακών κτημάτων στις παραδουνάβιες ηγεμονίες της Βλαχίας και Μολδαβίας. Επαναλειτούργησε μεταξύ των ετών 1881-1888 και διέκοψε και πάλι τη λειτουργία της μεταξύ των ετών 1888-1893. Επαναλειτούργησε με νέες σταθερές βάσεις από το 1893-1909, οπότε έκλεισε οριστικά. Στο δεύτερο αυτό διάστημα λειτουργίας της Σχολής (1888-1909), χρημάτισαν Σχολάρχες της ο Ιερόθεος Δημητριάδης, ο Φώτιος και πάλι, ο Γερμανός Βασιλάκης και ο Χρυσόστομος Παπαδόπουλος (1900-1909).
Στην πρώτη περίοδο η Σχολή εργάστηκε για μία εικοσαετία (1855-1876) και κατά τη δεύτερη και Τρίτη περίοδο επί τέσσερα έτη (1881-1884) και (1884-1888) και στην τέταρτη περίοδο επί δεκαέξι έτη (1893-1909). Συνολικά λειτούργησε για σαράντα πέντε περίπου χρόνια. Το 1905 πανηγύρισε την πεντηκονταετία της και έγινε σκέψη για προβιβασμό της σε Ακαδημία. Η Σχολή έδωσε πολλούς μορφωμένους, λόγιους συγγραφείς κληρικούς και λαϊκούς θεολόγους στην εκκλησίας Ιεροσολύμων και σ’ άλλες εκκλησίες.
Στην εποχή αυτή απασχόλησε ξανά την αδελφότητα το σιναϊτικό ζήτημα, λόγω του Ότι ο Αρχιεπίσκοπος Σιναίου Κύριλλος χειροτονήθηκε στην Κωνσταντινούπολη το 1859 και δεν αναγνώρισε τις ανέκαθεν υφιστάμενες σχέσεις πατριαρχείου Ιεροσολύμων και Αρχιεπισκοπής Σινά. Ύστερα από πολλές προσπάθειες συμβιβασμού, ο Κύριλλος Ιεροσολύμων καθαίρεσε τον Κύριλλο Σιναίου και χειροτόνησε αντ’ αυτού τον Καλλίστρατο. Στο εξής η Αρχιεπισκοπή Σινά είναι αυτόνομη και αυτοδιοίκητη με Αρχιεπίσκοπο υπό τη δικαιοδοσία του Ιεροσολύμων.
